【10-2019-0077797】 난자의 체외성숙 및 초기배 발달 향상을 위한 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 배양 방법 > 특허개발

【발명의 국문명칭】난자의 체외성숙 및 초기배 발달 향상을 위한 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 배양 방법

【발명의 영문명칭】Composition for in vitro oocyte maturation and early embryonic development comprising Mito-TEMPO and culture method using the same

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【출원일자】2019. 06. 28.​

【출원번호】10-2019-0077797​

​【발명자】​구덕본(Deog-Bon Goo), 박효진(Hyo-Jin Park), 양슬기(Seul-Gi Yang)

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​【기술분야】
 본 발명은 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 난자 체외 성숙용 조성물, 상기 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계를 포함하는 난자의 체외 성숙 방법, Mito-TEMPO를 포함하는 수정란의 체외 배양용 조성물 및 상기 체외 배양용 조성물이 첨가된 체외 배양용 배지에서 수정란을 체외 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다.

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【발명의 배경이 되는 기술】

 최근 출산 연령이 높아지고, 식습관의 변화 및 스트레스 등 다양한 원인에 의한 난임으로 인해 저출산 문제가 사회적인 문제로 알려져 있다. 이러한 난임 극복을 위한 치료 방법에는 보조 생식술, 인공수정 및 체외배양 시스템을 통한 체외수정과 배아 생성 등이 알려져 있다. 그 중 포유동물을 이용한 난모세포의 체외성숙을 통한 품질 향상 및 체외배양을 통한 배아 및 배반포의 생성 효율 증가는 착상 및 임신율의 증가로 이어지는바, 이에 대한 연구는 난임 문제의 극복을 위해 반드​시 필요하다. 그러나 수정란과 관련된 연구가 활발하게 이루어지고 있음에도 불구하고 현재 체외성숙 및 수정을 통해 생성된 배반포의 품질은 여전히 낮은 수준이다.
 대표적인 포유동물로 돼지의 난포란은 체외성숙(In vitro maturation) 시스템을 통해서 이루어지며, 성숙된 난자의 상태 및 품질은 향후 체외수정(In vitro fertilization)을 통한 배아(embryo) 및 배반포(blastocyst) 단계로의 발달과 관련되기 때문에 매우 중요하다. 현재 돼지 체외배양 시스템은 난소의 난포로부터 얻은 미성숙 난구세포·난모세포 복합체(COCs)를 체외 배양액 500μl에 50-60개 정도를 넣고 44시간 동안 성숙을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 체외배양 시스템을 통해 성숙된 난자 및 수정란 그리고 배아를 생성하는 과정은 체내와는 달리 배양하는 조건 그리고 환경에 따라 다양한 영향 및 손상을 받을 수 있다. 돼지 난모세포는 체외성숙 과정 동안 미토콘드리아로부터 생산되는 ATP(adenosine tri-phosphate)를 높은 수준으로 필요로 하는데, 일반적으로 ATP가 생산될 때 미토콘드리아 내막에 존재하는 호흡계 회로의 전자전달로부터 활성산소(reactive oxygen species: ROS)가 생성된다. 이러한 과정에서 세포 내 ROS가 축적되거나 다량으로 생성될 경우 산화적 스트레스 및 에너지 생산 감소 등의 문제가 발생하고, 미토콘드리아의 기능 저하와 같은 세포 내 손상을 일으킬 수 있다.​

 최근 이러한 미토콘드리아 유래 초과산화물의 생성은 미토콘드리아의 기능, 다이나믹스(dynamics) 및 세포 사멸과 관련되는 것으로 보고되었다. 구체적으로, 미토콘드리아 유래 초과산화물을 포함하는 활성산소의 과도한 생성은 미토콘드리아 분열 반응 또는 불충분한 미토콘드리아 융합에 의해 미토콘드리아 단편화(fragmentation)를 유도한다. 이러한 미토콘드리아 단편화는 세포 내 호흡 및 에너지 생산 감소로 이어지며, 나아가 미토콘드리아 막전위(mitochondria membrane potential: MMP)가 무너지고 미토콘드리아 유래 세포 사멸까지 이어질 수 있다.

 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)는 대표적인 환경호르몬으로서 플라스틱류, 비닐 등에 함유되어 있는 물질이다. 이러한 BPA는 세포 내에서 산화적 스트레스, 세포 사멸, 세포기능 이상을 일으키고, 성 호르몬인 에스트로겐을 교란시켜 생식 기관의 장애를 유발시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에서 BPA는 중요 세포 소기관인 미토콘드리아의 기능 이상, 미토콘드리아 유래 활성산소의 생성 및 세포 사멸과도 관련 있는 것으로 보고되었다.　이러한 BPA는 난모세포의 체외성숙 및 수정란의 체외배양 과정에서 사용되는 플라스틱 디쉬(dish) 또는 보관 용기로부터 노출될 수 있으며, 이 경우 BPA 유래 미토콘드리아 초과산화물 생성은 난자의 핵 성숙율 및 성숙된 난자의 발달 효율을 저하시키는 주요 원인이 될 수 있다.
 한편, 체외수정에 의한 수정란을 체외 배양하는 과정에 있어서, 세포질 내 지질 함유량에 따라 비균등한 세포질이 관찰되는 수정란의 경우 배반포로의 발달에 필요한 균등한 난할 및 원활한 ATP 공급 여부 등의 차이로 인해 이후 발달 과정에서 비균등 난할을 보이거나 발달의 진행이 정지될 수 있으며, 나아가 세포 사멸이 일어나는 비율 또한 높은 것으로 알려져 있다. 이에, 체외수정에 의해 생성된 수정란이 균등하지 않은 세포질을 나타낼 경우 체외 배양시 정상적인 배반포로의 발달율이 현저히 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.
 이러한 배경 하에, 본 발명의 발명자들은 최근 미토 템포(Mito-TEMPO)를 이용한 미토콘드리아 내 초과산화물 생성 조절과 이에 따른 기능 유지를 포유동물의 초기배 발달 과정 동안 새로운 조절 메커니즘으로 제시한바 있으며, 이를 기초로 포유동물 난자의 체외 성숙 및 배양을 위한 조성물 및 배양 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, Mito-TEMPO를 포함하는 난자 체외 성숙 및 배양용 조성물이 BPA에 의한 미토콘드리아 내 초과산화물 생성을 억제하여 난자의 핵 성숙율 및 성숙된 난자의 발달 효율을 증가시키고, 비균등 세포질이 관찰되는 수정란에 대해서도 배판포로의 발달 효율을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

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【요약】
 본 발명은 미토 템포(Mito-TEMPO)를 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 조성물, 상기 배양액 조성물이 첨가된 체외 성숙용 배지에서 난자를 체외 성숙시키는 단계를 포함하는 난자의 체외 성숙 방법, Mito-TEMPO를 포함하는 수정란의 체외 배양용 조성물 및 상기 체외 배양용 조성물이 첨가된 체외 배양용 배지에서 수정란을 체외 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다.
 본 발명의 Mito-TEMPO를 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 조성물 또는 수정란의 체외 배양용 조성물은 포유동물의 미성숙 난자 또는 체외 수정에 의해 생성된 수정란의 성숙 및 발달 과정에서 미토콘드리아 유래 초과산화물을 제거함으로써 핵 성숙율을 증가시키거나 수정란의 난할율 및 배반포 단계로의 발달 효율을 증가 시키는 바, 난자의 성숙 효율 및 초기배(early embryo) 품질 개선을 통해 난임 환자를 대상으로 한 체외/인공 수정시 착상 효율을 높이거나, 난임 기전에 대한 연구 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.​